实验方法总结（4）：组织水平部分

1、免疫组化

1.1 SP法

单克隆抗体MMP-2、MMP-9,SP试剂盒购自ZYMED公司(1 100)。3%H₂O₂封闭内源性过氧化物酶,微波加热抗原修复, 10%正常羊血清孵育,滴加一抗, 4℃冰箱中过夜, PBS缓冲液(Na₂HPO₄ 8.1 mmol/L,KH₂PO₄1.5mmol/L,NaCl 137mmol/L, 2.7 mmol/L pH 7.4)振荡清洗后分别滴加二、三抗,DAB显色,苏木素复染,常规封片。

1.2 双层夹心ELISA法

    以纯化后的多克隆抗体作为捕获抗体，以本实验室已经制备的抗LM Internalin A 单克隆抗体3R6为检测抗体，建立双抗夹心ELISA 方法。具体步骤如下：多克隆抗体稀释液 →洗板3次→3% BSA封闭 →洗板3次→待测菌稀释液 →洗板3次→单克隆抗体稀释液 →洗板4次→酶标羊抗鼠IgG →洗板5次→TMB显色液→ 终止液→测定OD450值抗体、抗原和BSA 稀释液均为0.01mol/L、pH7.4PBS。洗板液为含 0.1% Tween-20 的 0.01 mol/L、pH7.4PBS(PBST)。结果判定：以(测定孔 OD 值－空白对照孔OD 值)/(阴性对照孔 OD 值－空白对照孔 OD 值)≥ 2.1(即P/N ≥ 2.1)时判断为阳性。

1.3胶体金法

    ① 器皿洗涤准备,将锥形瓶等实验所用的玻璃器皿放入由重铬酸钾和浓硫酸配制的酸液中浸泡 48 h，取出后用蒸馏水反复冲洗，并用超纯水漂洗 3~4 次，烘干待用。②胶体金的制备 胶体金熬制方法参照文献 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，具体方法步骤如下：在含有 99 mL 超纯水的干净锥形瓶中加入 1 mL 1%氯金酸溶液，配制成 100 mL 0.01%氯金酸溶液；用恒温电磁力搅拌器不断搅拌加热沸腾；氯金酸溶液煮沸后快速加入 1%柠檬酸三钠并不断搅拌，溶液颜色变成紫红色后，继续回流 10 min 后停止加热，冷却至室温，存放 4 ℃冰箱备用。③胶体金标记抗克伦特罗单克隆抗体 胶体金标记抗体制备金标抗体探针的方法参照文献进行：取适量熬制好的胶体金溶液至烧杯中，用 0.2 mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液 pH 至6.0，超纯水溶解抗体至胶体金 1/10 体积，并逐滴加入胶体金溶液，搅拌反应 30 min（抗体标记浓度分别为 0.5 μg/mL、1 μg/mL 以及 2 μg/mL），然后按胶体金 1/10 体积逐滴加入 10% BSA，搅拌封闭 30 min，继续按胶体金 1/10体积逐滴加入 1% PEG 20000，搅拌封闭 30 min 后，9000 rpm 离心 30 min，吸去上清后加入原体积 1/10 的复溶液（含 1% BSA、2%蔗糖、0.05% PEG20000、0.1% NaN₃的 pH 7.4 0.02 mol/L 的磷酸盐缓冲液）重悬金标抗体。④CLE 胶体金试纸条免疫反应动力学分析  在阴性混合猪尿中添加 CLE 标准品至浓度分别为 0、0.2、0.5、1.0 ng/ml,分别取 70 μl加入试纸条加样孔，胶体金读数仪每隔 30S 测定试纸条 T、C线值以及 T/C 比值，跟踪记录加样后 30 min。并以 T、C 线值以及 T/C 比值为纵坐标，时间为横坐标，绘制动力学曲线，观察试纸条 T、C 线值，T/C比值随浓度和时间的变化。以动力学曲线变化间接反应试纸条 T、C 线上抗原抗体免疫学反应。

2、HE染色

1.脱蜡：①二甲苯Ⅰ脱蜡10min 左右（自动染色机染10min）；②二甲苯ⅡⅢ脱蜡5min 左右（自动染色机染10min）；③无水酒精（乙醇）Ⅰ洗去二甲苯1min（机染1min）；④无水酒精（乙醇）Ⅱ洗去二甲苯1min（机染1min）；⑤95%酒精1min（机染1min）；⑥85%酒精1min（机染1min）；⑦自来水洗片刻（机染1min）。2.染色：①苏木素染色1～5min 左右（机染1～5min）；②自来水洗片刻（机染1min）；③1%或0.5%或0.25%盐酸水分化3～5s（机分化30s）；④自来水洗，温水蓝化片刻（机洗5min）；⑤伊红酒精染液浸染20s～2min（机染30s～5min）。3. 脱水、透明、封固：①85%的酒精脱水20s（机染20s）；②95%的酒精1min（机染1min）；③无水酒精Ⅰ染1～2min（机染2min）；④无水酒精Ⅱ染2min（机染2min）；⑤二甲苯Ⅰ浸2min（机染2min）；⑥二甲苯Ⅱ浸2min（机染2min）；⑦中性树胶或加拿大树胶封片。

3、原位杂交

锁核酸探针荧光原位杂交（Fluorescence In situ hybridization, FISH）及免疫荧光双标于同一切片行 miR-129-5p 和Ⅰ型胶原及整合素 α1 的双标染色冰冻切片充分干燥后 DEPC-PBS 润洗 ，0.3%的 TritonX100 浸泡 10 分钟， 20μg/ml 蛋白酶 k 消化 5 分钟，DEPC-PBS 漂洗 2 次，每次 5 分钟，加入杂交液（由 SSC、blocking reagent、Formamide、NLS、SDS 构成）与 60℃预杂交 1 小时，加入 miR-129-5p LNA 探针（20nM），83 度变性 5 分钟，53℃孵育 20 小时，预热至 60℃的 Wash Buffer（由 SSC、Formamide、NLS 构成）冲洗 2 遍，遍20 分钟，RNasebuffer 室温孵育 5 分钟，含 20μg/mlRNsae A 的 RNase buffer37℃孵育半小时，2×SSC 0.1%NLS 37℃ 20 分钟 2 次，0.2×SSC 0.1%NLS 37℃ 20 分钟 2 次，TBS（由 Blockingreagent、Tris-HCl、NaCl溶液构成）室温孵育 1 小时，加入 POD-DIG 及免疫荧光用的一抗（Ⅰ型胶原或整合素α1）室温过夜，TS9.5（Tris-HCl、NaCl、MgCl₂构成）室温润洗 2 次，每次 10 分钟，TSA(TM)Biotin System 处理 30min，加入 Alexa488 标记的羊抗兔 IgG 及 cy3-avidin 室温避光孵育 4 小时，DAPI 衬染，TNT 溶液室温润洗 3 遍，每遍 5 分钟，甘油封片，激光共聚焦显微镜观察。