免疫荧光细胞化学染色方法

免疫荧光细胞化学染色方法

一、标本制作

可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片,经适当固定或不固定,作免疫荧光染色用。

二、荧光抗体染色方法

(一)直接法

1.染色 切片经固定后,滴加经稀释至染色效价如1:8或1:16的荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等),在室温或37℃染色30min,切片置入能保持潮湿的染色盒内,防止干燥。

2.洗片  倾去存留的荧光抗体,将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次,搅拌,每次5min,再用蒸馏水洗1min,除去盐结晶。

3.用50%缓冲(0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0~9.5)甘油封固、镜检

4.对照染色

①正常免荧光血清染色,如上法处理切片,结果应为阴性。②染色抑制试验(一步法):将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致,可用盐水代替未标记抗血清,染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验,前面已作叙述。

直接法比较简单,适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原,特异性高而敏感性较低。

(二)间接法

(1)切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液体。

(2)再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。

对照染色:①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结果应为阴性。②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。③阳性对照。

间接法中上述方法称双层法(Double Layer Method)。另一种称夹心法,即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下:

①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。

②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min。

③缓冲盐水洗2次,每次5min,吹干。

④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃,30min。

⑤如③水洗。

⑥缓冲甘油封固,镜检。

间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原,敏感性较高,操作方法较易掌握,而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)等的研究和检查,所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。

(三)补体法

1.材料

(1)免疫血清60℃灭活20min,用Kolmers 盐水作2倍稀释成1:2,1:4,1:8……。补体用1:10稀释的新鲜豚鼠血清,抗补体荧光抗体等,按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价,如为1:32则免疫血清应作1:8稀释。

(2)补体用新鲜豚鼠血清一般作1:10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果,按2单位的比例,用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中,溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。

(3)抗补体荧光抗体:在免疫血清效价为1:4,补体为2单位的条件下,用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价,然后按染色效价1:4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。

2.方法步骤

(1)涂片或切片固定。

(2)吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液(此时免疫血清及补体又都稀释一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定湿度的染色盒内。

(3)用缓冲盐水洗2次,搅拌,每次5min,吸干标本周围水液。

(4)滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min,37℃,水洗同(3)。

(5)蒸馏水洗1min,缓冲甘油封固。

3.对照染色

(1)抗原对照。

(2)抗血清对照:用正常兔血清代替免疫血清。

(3)灭活补体对照:将补体经56℃30min处理后,按补体同样比例稀释,与免疫血清等量混合后,进行补体法染色。

本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制,因而一种荧光抗体可作更广泛的应用,敏感性亦较间接法高,效价低的免疫血清亦可应用,节 省免疫血清,尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。

(四)膜抗原荧光抗体染色法

本法应用直接法或间接法的原理和步骤,可对活细胞在试管内进行染色,常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究,阳性荧光主要在细胞膜上。FACS即采用此法原理。

(五)双重染色法

在同一标本上有两个抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原),A抗原的抗体用FITC标记,B抗原的抗体用罗达明标记,可采用以下染色方法:

1.一步法双染色  先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B),按直接法进行染色。

2.二步法双染色 先用RB200标记的B抗体染色,不必洗去,再用FITC标记的A抗体染色,按间接法进行。

结果:A抗原阳性荧光呈现绿色,B抗原阳性呈现桔红色荧光。

(六)荧光抗体再染色法

若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后,未获得阳性结果,而又疑有另外的病原体存在时,可用相应的荧光抗体再染色。

有时存档蜡块不能再用以切片,也可用存档的HE染色标本,褪去盖片和颜色,再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。

三、荧光抗原染色法

某些抗原可以用荧光素标记,制成荧光抗原,标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体,特异性较好,敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵,一般很少采用此法。

 

如若转载,请注明出处:https://www.ouq.net/3497.html

(0)
打赏 微信打赏,为服务器增加50M流量 微信打赏,为服务器增加50M流量 支付宝打赏,为服务器增加50M流量 支付宝打赏,为服务器增加50M流量
上一篇 1天前
下一篇 1天前

相关推荐

  • CUT&Tag and CUT&RUN

    CUT&Tag: An Introduction  CUT&RUN, Cleavage Under Targets & Tagmentation (CUT&Tag) is a faster, more cos…

    1天前
    27
  • CUT&Tag技术和原理

    CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)技术是一种用于细致地研究蛋白质与DNA相互作用的方法,特别适用于研究转录因子、组蛋白修饰等蛋白质在基因组上的精确结合位置。许多染色质特征…

    1天前
    38
  • 荧光原位杂交技术原理及操作步骤

     1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用,提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交,即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上,标志着染色体定位…

    实验方法 1天前
    28
  • 免疫组化常见问题的处理

    免疫组化常见问题的处理

    实验技术 1天前
    32
  • 免疫组化非特异性染色的消除方法

    免疫组化非特异性染色的消除方法 一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂,其产生的原因主要可分为以下几点:(1)一部分荧光素未与蛋白质结合,形成了聚合物和衍化物,而不能被透析除去。(2)抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧…

    实验方法 1天前
    24