CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技术是一种用于细致地研究蛋白质与DNA相互作用的方法，特别适用于研究转录因子、组蛋白修饰等蛋白质在基因组上的精确结合位置。许多染色质特征在调节基因表达中起着关键作用。要完全了解基因调控，就需要以高分辨率绘制小细胞样本中的特定染色质特征。 CUT&Tag是一种酶结合策略，可提供高效的高分辨率测序文库，用于分析各种染色质成分。在 CUT&Tag 中，染色质蛋白被特异性抗体原位结合，然后结合蛋白 A-Tn5 转座酶融合蛋白。转座酶的激活可有效生成具有高分辨率和极低背景的片段文库。从活细胞到可测序文库的所有步骤都可以在台式单管或高通量管道中的微孔中进行，整个过程可以在一天内完成。通过分析低细胞数和单细胞上的组蛋白修饰、RNA 聚合酶 II 和转录因子来展示 CUT&Tag 的实用性。
原位杂交用于 CUT&Tag 染色质分析。a CUT&Tag 中的步骤。添加的抗体（绿色）与基因组中核小体（灰色椭圆）之间的目标染色质蛋白（蓝色）结合，多余的抗体被洗掉。添加第二抗体（橙色）并增强 pA-Tn5 转座体（灰色框）在抗体结合位点的束缚。洗掉多余的转座体后，添加 Mg++ 可激活转座体并在染色质蛋白结合位点整合接头（红色）。DNA 纯化后，两端带有接头的基因组片段通过 PCR 富集。b CUT&Tag 在固体支持物上进行。未固定的细胞或细胞核（蓝色）被透化并与针对目标染色质蛋白的抗体混合。将细胞添加并结合到 Concanavilin A 包被的磁珠 (M) 上后，所有后续步骤均在同一反应管中进行，并在洗涤和孵育之间进行磁捕获，包括 pA-Tn5 束缚、整合和 DNA 纯化
实验设计
- 目标蛋白的选择：实验首先确定目标蛋白，例如一个特定的转录因子或一个特定的组蛋白修饰。在这个例子中，我们假设目标是转录因子TFX。
- 细胞样本准备：从相关的生物体（如人类、小鼠等）中准备细胞样本。这些细胞应该表达目标蛋白TFX。
- 抗体的使用：实验使用针对TFX的特异性抗体。这些抗体能够精确地结合到TFX蛋白上。
- 转座酶的加入：随后，加入转座酶（如Tn5转座酶）。这种酶能结合到抗体-蛋白复合体上，并在其附近的DNA上插入小片段的DNA序列，从而在这些区域创建标记。
- DNA的提取和测序：实验提取这些标记的DNA片段，然后进行高通量测序。
数据类型和分析
- 数据类型：测序产生的是大量短DNA读段（reads），这些读段代表了TFX蛋白结合的DNA区域。
- 质量控制：首先对测序数据进行质量控制，确保数据的可靠性。
- 读段比对：利用生物信息学软件（如Bowtie2或BWA）将这些读段比对到参考基因组。
- 峰值检测：使用如MACS2等工具分析比对后的数据，识别出TFX结合的DNA区域（即读段富集的区域）。
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